在顯微鏡的光學系統中，光源、聚光鏡、物鏡和目鏡的光軸以及光闌的中心必須與顯微鏡的光軸同在一直線上，所以在鏡檢前必須進行顯微鏡光軸的調節，否則不能達到較佳觀察效果。
1、光源燈絲調節：舊式顯微鏡需要調節燈泡的位置。目前的新型顯微鏡的光源已經進行了預定心設置，所以不需要調整。
2、聚光鏡的中心調整：實際上顯微鏡光軸調整的重點即是聚光鏡的位置調整。
首先將視場光闌縮小，用10X物鏡觀察，在視場內可見到視場光闌的輪廓，如果不在中央，則利用聚光鏡外側的兩個調整螺釘將其調至中央部分，當緩慢地增大視場光闌時，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內接，說明已經和軸。和軸后再略為增大視場光闌，使輪廓像剛好處于視場外切或略大。
3、孔徑光闌的調節：孔徑光闌安裝在聚光鏡內，研究用顯微鏡的聚光鏡的外側邊緣上都有刻度數及定位記號，這樣便于調節聚光鏡與物鏡的數值孔徑相匹配，原則上說更換物鏡時需調整聚光鏡的數值孔徑，一般物鏡的數值孔徑乘0.6或0.8就是聚光鏡的數值孔徑。
